primary chondrocytes culture(연골 세포 배양)

 

연골세포를 배양하기 위해선 임신 15일차의 쥐에서 배속에 아기가 필요하다.

 

임신쥐배에서 꺼내진 아이들

 

 

위 사진처럼 임신 쥐를 머리를 고정시켜준 후 꼬리를 잡아당겨 경추탈골 시켜준 후

 

1.배속에 아기들을 꺼내고 하반신을 잘라 준다.

 

2.잘린 하반신을 PSA(4’c)에 담가 둔다.

 

아래 그림을 보면 우리가 필요한 뼈는 Tibia, 와 Femur이다.

mouse 다리 뼈 

 

실제로 잘린 하반신을 현미경으로 보면 이렇다.

100파이 dish에 PSA를 넣어 놓고 현미경으로 보면서 작업을 하면 좋다.

주황색으로 된 뼈가 필요하다.

 

3. 하반신의 Forceps으로 닭다리살을 바르듯이 발라 준다. 생각보다 뼈가 물컹하니 조심해서 발라준다. 뼈가 부러져도 상관없으니 천천히 하면 된다.

 

어느정도 발라 줬으면 아래 사진처럼 나올 것이다.

 

지저분한 다리 뼈

우리가 배양하는데 필요한 세포들은 저 빨간색 동그라미에 있다.

그리고 살점들은 Forceps으로 더 발라 준다. (파란색 화살표)

어느정도 작업을 했으면, 아래 사진처럼 모였을 것이다.

 

 

4. 이렇게 모인 뼈들을 organ culture media에 담가서 cell culture incubator O/N(Overnight)

 

5. 다음날 organ culture media를 최대한 제거 후 15ml tube에 T/E 500ul씩 첨가 후 parafilm으로 막고 37℃에서 15min incubation (100rpm에서 shaking)

 

6. T/E 제거 후, 각각의 15ml tube에 3mg/ml collagenase P solution 6ml씩 넣고 뚜껑 닫고parafilm으로 막는다 → 37℃에서 2hrs동안 Incubation (1000rpm shaking)

 

7. 6번의 cell들을 10%FBS Primary chondrocyte media를 6ml씩 넣고cell strainer를 통해 한번 걸러주고

1000rpm 5min RT

 

8. soup 제거 후 10% FBS Primary chondrocyte media를 넣어서 resuspension 후

 

9. cell counting 후 seeding.

 

 

실험을 하지 않고 처음 이 글을 본다면 많이 헷갈릴 수 있을 것 같다.

나중에 시간이 되면 영상으로 제작해 보겠다.

--

준비물