NO, Nitrite assay (NO production quantitative analysis)

96well

 

🧪 Measurement of Nitric Oxide (NO) Production Using Griess Assay – Experimental Protocol & Data Analysis

🔬 Overview of the Experiment

Nitric oxide (NO) plays a crucial role in cell signaling and immune responses. However, due to its high reactivity and short half-life, direct measurement of NO is challenging. Instead, NO is commonly quantified indirectly by measuring its stable breakdown product, nitrite (NO₂⁻), in cell culture supernatants.

The Griess Assay is a well-established colorimetric method that measures NO₂⁻ concentration. This reaction involves Griess reagent, which reacts with NO₂⁻ to form a pink-colored azo dye, and the absorbance of this dye is measured to determine nitrite levels.

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📝 Experimental Procedure

1️⃣ Preparation of Samples and Controls

1. Transfer 50 µl of the culture supernatant (cell-free culture medium) into a new 96-well plate.
   • Be careful not to touch the bottom of the wells with the pipette tip.
   • Ensure that cells do not mix with the culture supernatant.
   • The remaining cells in the original plate can be used for the MTT assay (cell viability test).

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2️⃣ Preparation of NaNO₂ Standard Curve

• Add 50 µl of distilled water (D.W.) into wells A-G of columns 1 and 12 (used for standard curve).
• Pipette 50 µl of NaNO₂ (10 µg/ml) into wells H and G.
• Perform two-fold serial dilutions from well G to well B, ensuring that the final volume in each well is 50 µl.
  • For each dilution step, transfer 50 µl from one well to the next.
  • Do not add NaNO₂ to well A (blank control).

Well                                                                          NaNO₂ Concentration

H	10 µg/ml
G	5 µg/ml
F	2.5 µg/ml
E	1.25 µg/ml
D	0.625 µg/ml
C	0.3125 µg/ml
B	0.15625 µg/ml
A (Blank)	0 µg/ml

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3️⃣ Addition of Griess Reagent

1. Add 50 µl of Griess reagent to each well, including the blank and sample wells.
   • Griess Reagent Composition:
     • 1% sulfanilamide (0.5 g)
     • 0.1% naphthylethylenediamine dihydrochloride (0.05 g)
     • 2% phosphoric acid (1.18 ml)
     • Final volume: 50 ml (adjusted with D.W.)
2. Carefully remove any bubbles from the wells to avoid errors in absorbance measurements.
3. Measure absorbance within 30 minutes to prevent color degradation.

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4️⃣ Measuring Nitrite Concentration (NO Production)

1. Set a plate reader or spectrophotometer to 540 nm wavelength.
2. Remove the lid from the plate before placing it in the reader.
3. Measure the absorbance of each well at 540 nm.
4. Compare the sample absorbance values with the NaNO₂ standard curve to calculate NO₂⁻ concentration.

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📊 Data Analysis

1. Constructing the NaNO₂ Standard Curve

• Plot absorbance values (y-axis) against known NaNO₂ concentrations (x-axis).
• Generate a linear regression equation (y = mx + b) to calculate NO₂⁻ concentration in unknown samples.

2. Calculating NO Concentration in Samples

• Use the equation from the standard curve to determine NO₂⁻ concentration.

🔹 Example Calculation:

• Standard curve equation: y = 0.15x + 0.02
• Sample OD reading: 0.38
• Solve for x:
  • 0.38 = 0.15x + 0.02
  • x = (0.38 - 0.02) / 0.15
  • x = 2.53 µM NO₂⁻ (final concentration in sample)

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🚨 Important Precautions

✅ Perform triplicate (n=3) experiments to ensure reproducibility.
✅ Remove bubbles before measuring absorbance.
✅ Measure within 30 minutes to avoid signal degradation.
✅ Always generate a new NaNO₂ standard curve for each experiment.
✅ Keep experimental conditions consistent for accurate comparison.

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🎯 Comparison: Griess Assay vs. Other NO Detection Methods

Method                                        Principle                                      Advantages                   Limitations

Griess Assay	Measures nitrite (NO₂⁻) using a colorimetric reaction	Simple, inexpensive, widely used	Measures NO₂⁻ only, not NO directly
DAF-FM DA Fluorescence	Fluorescent probe reacts with NO	Direct NO detection, high sensitivity	Prone to photobleaching, requires specialized equipment
EPR (Electron Paramagnetic Resonance)	Detects NO radicals with spin trapping agents	Highly precise, direct NO detection	Expensive, requires advanced instrumentation

📌 Griess Assay is a cost-effective method but only measures NO₂⁻, not NO directly.
📌 For precise NO detection, fluorescence-based (DAF-FM DA) or EPR methods may be more suitable.

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✅ Conclusion

✔️ The Griess Assay is a reliable method for measuring NO production by detecting nitrite (NO₂⁻).
✔️ A NaNO₂ standard curve allows indirect quantification of NO levels.
✔️ Bubble removal and rapid measurement (within 30 min) are crucial for accuracy.
✔️ While the Griess Assay is simple and effective, direct NO measurement techniques such as DAF-FM DA fluorescence or EPR may be preferred in some cases.

 

 

세포가 많지 않으면 NO가 안뜸 95%이상 차있어야함.

 

🧪 Griess Assay를 이용한 Nitric Oxide (NO) 생산 측정법 – 실험 프로토콜 & 데이터 분석

🔬 실험 개요

Nitric oxide(NO)는 세포 신호전달과 면역 반응에서 중요한 역할을 하는 분자로, 직접 측정하기 어렵지만 안정적인 분해산물인 **아질산염(Nitrite, NO₂⁻)**을 정량적으로 분석하면 NO 생산량을 간접적으로 측정할 수 있음.
Griess Assay는 아질산염을 정량적으로 분석하는 대표적인 방법으로, Griess 시약과 반응하여 형성되는 azo dye의 색깔을 측정하여 NO의 농도를 계산할 수 있음.

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📝 실험 절차 (Procedure)

1️⃣ 샘플 및 대조군 준비

1. 96-well plate에 **50 µl의 배양액(세포 배양액의 상층액, supernatant)**을 새로운 well에 옮김.
   • 주의: pipette tip이 plate 바닥을 찌르지 않도록 조심해야 함.
   • 세포와 배양액이 섞이지 않도록 pipetting 주의!
   • 배양 plate에 남은 세포는 MTT assay (세포 생존율 측정)에 사용 가능.

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2️⃣ NaNO₂ 표준 곡선(Standard Curve) 작성

• 라인 1과 12의 A~G well에 D.W. 50 µl씩 첨가함 (Blank & Standard 준비)
• H, G well에 NaNO₂ 50 µl (10 µg/ml) 첨가
• G~B well까지 2배 희석 (two-fold serial dilution) 진행
  • 즉, G에서 50 µl → F로 옮기고, 다시 50 µl → E로 옮기는 방식으로 진행
  • 최종적으로 각 well의 총 부피는 50 µl 유지
  • A well은 blank (NaNO₂ 없음)

Well                                                                           NaNO₂ 농도

H	10 µg/ml
G	5 µg/ml
F	2.5 µg/ml
E	1.25 µg/ml
D	0.625 µg/ml
C	0.3125 µg/ml
B	0.15625 µg/ml
A (Blank)	0 µg/ml

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3️⃣ Griess 시약 첨가

1. 각 well에 Griess 시약 50 µl 첨가
   • Griess Reagent 구성
     • 1% sulfanilamide (0.5 g)
     • 0.1% naphthylethylenediamine dihydrochloride (0.05 g)
     • 2% phosphoric acid (1.18 ml)
     • 최종 부피: D.W.로 50 ml 보충
2. Bubble(기포) 제거 → 데이터 정확도 향상을 위해 필수!
3. 30분 내에 측정해야 함 (시간이 지나면 색 변질 가능).

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4️⃣ NO(Nitrite) 농도 측정

1. Plate reader 또는 spectrophotometer를 540 nm로 설정.
2. Plate 뚜껑을 제거하고 기기에 삽입.
3. 각 well의 흡광도(absorbance) 측정.
4. NaNO₂ 표준 곡선(standard curve)과 비교하여 시료 내 NO 농도를 계산.

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📊 데이터 분석 (Data Analysis)

1. NaNO₂ 표준 곡선 작성
   • 표준 용액(known NaNO₂ 농도)의 흡광도를 x축(NO₂⁻ 농도)과 y축(흡광도, OD 540 nm)으로 플로팅
   • 선형 회귀식(y = mx + b) 도출 → 샘플의 NO 농도 계산
2. 샘플의 NO 농도 산출
   • 실험 샘플의 흡광도를 표준 곡선에 대입하여 NO₂⁻ 농도(µM) 계산
   • 예:
     • 표준 곡선이 y = 0.15x + 0.02 라면, 샘플의 OD 값이 0.38일 때:
     • 0.38 = 0.15x + 0.02
     • x = (0.38 - 0.02) / 0.15
     • x = 2.53 µM (샘플 내 NO₂⁻ 농도)

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🚨 실험 시 주의할 점

✅ 반드시 triple(3회 반복) 실험 진행하여 데이터 신뢰도 확보
✅ Plate에 bubble이 생기지 않도록 조심!
✅ Griess 시약 첨가 후 30분 이내 측정 필수 (색 변질 방지)
✅ NaNO₂ 표준 곡선은 매 실험마다 새롭게 작성하여 편차 줄이기
✅ Sample 간 비교 시 동일 조건 유지 (배양 시간, 배양액 처리 등)

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🎯 Griess Assay vs 다른 NO 측정법 비교

측정법                                          원리                                                  장점                              단점

Griess Assay	NO₂⁻를 Griess 시약과 반응시켜 색 변화 측정	간단하고 저렴함	NO₂⁻만 측정 가능 (NO 직접 측정 불가)
DAF-FM DA Fluorescence	NO와 반응하여 형광 신호 발생	NO 직접 측정 가능	형광 소멸 가능성, 백그라운드 신호 문제
EPR (Electron Paramagnetic Resonance)	NO와 특정 spin trap이 결합하여 신호 검출	NO 직접 검출 가능, 정밀한 데이터	비용이 높고, 복잡한 장비 필요

📌 Griess Assay는 빠르고 간편하지만, NO의 직접적인 측정이 아닌 NO₂⁻(분해산물)만 측정 가능!
📌 보다 정밀한 NO 측정이 필요하다면 DAF-FM DA 형광법 또는 EPR 사용 가능!

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✅ 결론

✔️ Griess Assay는 NO₂⁻ (아질산염)를 측정하여 세포 배양액 내 NO 생산을 간접적으로 평가하는 방법
✔️ NaNO₂ 표준 곡선을 사용하여 샘플 내 NO 농도 산출 가능
✔️ 반드시 triple 실험을 진행하고, bubble 제거 & 30분 내 측정 필수
✔️ NO 직접 측정이 필요한 경우 DAF-FM DA 형광법 or EPR 사용 고려 가능

 

 

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