Primary mixed glia preparation (Mixed glia prep 후 세포배양)

 

생후 2 일 ICR mouse 준비

+준비물 : autoclave 된 수술 도구, 토치, 수술 도구 소독 용 70% Et.OH을 담은 비커, 70% Et.OH를 10ml 담은 petri dish 2개, DMEM 담은 10ml 100π dish 2개

 

1.     생후 2일 ICR mouse 준비. (어미 1마리당 새끼 8-12마리)

2.     쥐를 70% Et.OH에 살짝 담가 소독한 후 소독한 가위로 목을 자른다.

3.     70% Et.OH를 담은 petri dish에 담가 피를 뺀다. (오래 담가두지 말 것)

4.     10% DMEM에 담근다.

5.     코 부위를 소독한 핀셋으로 잡고 목 쪽 빈 공간에서부터 일직선으로 위로 자른다. (자를 때는 살짝 들어올리는 느낌으로) 목 쪽 빈 공간에서부터 중앙에서 양 귀 부분을 가로로 자른다. (바깥 쪽으로 밀 듯)

6.     핀셋으로 껍질을 벗겨 brain을 적출 하여 10% DMED에 담근다.

7.     적출한 brain을 멸균한 filter paper에 굴려 피를 제거한 후 10% DMEM dish 위에 둔 70um nylon mesh 안에 담는다.

8.     70um nylon mesh 위의 bratin을 e-tube를 이용하여 잘게 간다.

9.     50ml tube 위에 nylon mesh를 얹어 한 번 더 통과시킨다.

10.  1,500rpm 10min centrifuge.

11.  상층액만 제거한다.

12.  1마리 당 10ml 씩 계산하여 DMEM을 첨가하여 잘 pipetting 후 seeding

(microglia 용 : culture dish, astrocyte 용 : 75T-flask)

13.  37℃ incubator에서 5일 incubation 후 배지 change 후 2-3일 간격으로 배지 change

14.  Microglia의 경우 약 3주간 culture 하나 후 분리하여 실험에 사용