인간 미세아교세포의 파고좀을 ‘그대로’ 분석하는 법?

"Rapid phagosome isolation enables unbiased multiomic analysis of human microglial phagosomes” (Wogram et al., Immunity, 2024)

최근 Immunity에 실린 이 논문은 하나의 질문에서 시작한다.
“Microglia가 시냅스를 삼켰을 때, 그 안에서는 무슨 일이 벌어지고 있을까?”

우리는 그동안 microglia가 시냅스나 debris를 phagocytosis 한다는 건 알고 있었지만, 삼킨 다음 phagosome 내부가 어떤 구성이고, 무슨 대사가 일어나는지는 직접 들여다보기 어려웠다.
왜냐면… phagosome만 분리해내는 게 너무 어렵기 때문.  

논문 다운로드 : https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1074761324003686?via%3Dihub

(배경지식 더보기 클릭)

1. ✅ Microglia의 Phagocytosis와 Phagosome 형성

내용설명

Microglia	뇌의 면역세포, 손상된 시냅스나 세포 조각을 삼켜서 제거
Phagosome	microglia가 이물질을 삼킨 뒤 세포막으로 감싸 만들어지는 소포
후속 경로	phagosome은 lysosome과 융합해 내용물을 분해함

 

🔍 이 논문은 phagosome만 분리해서 그 안의 단백질, 대사체를 분석함

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2. ✅ CD68: Phagosome 마커 단백질

항목설명

CD68	phagosome, endolysosome, lysosome에 존재하는 막 단백질
사용 이유	phagosome만 선택적으로 **면역정제 (IP)**하기 위해 사용됨

 

💡 논문은 CD68 IP 방식으로 phagosome을 20분 내로 분리

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3. ✅ Kynurenine Pathway와 Quinolinic Acid (QA)

항목설명

Tryptophan 대사	염증 반응 시 IDO1/2에 의해 kynurenine → QA로 전환됨
Quinolinic Acid (QA)	NMDA 수용체 agonist, neurotoxic하지만 동시에 NAD⁺의 전구체
QPRT	QA를 **NA(Nicotinic acid)**로 전환하는 효소 → NAD⁺ 생성 시작점

 

📌 논문은 QA가 phagosome 안에서 QPRT에 의해 NAD⁺로 전환됨을 보여줌

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4. ✅ Mass Spectrometry 기반 Proteomics & Metabolomics

기법설명

LC-MS	단백질/대사체를 질량 스펙트럼으로 정량하는 기술
이 논문에선?	phagosome 분획에서 단백질 조성과 QA, NA, NAD⁺ 등 대사체 정량 분석함

 

💡 단백질과 대사체를 compartment 단위로 분석한 다중오믹스 (multi-omics) 연구

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5. ✅ Microglia와 Neuron의 상호작용 모델 (co-culture)

항목설명

단독 배양 (monoculture)	iMG만 배양 → 비교적 비활성 상태
공동 배양 (co-culture)	neuron + iMG 배양 → in vivo-like phenotype 유도됨
이 논문에서는?	co-culture 환경에서 microglia의 phagosome 구성 변화와 유전자 발현 변화(RNA-seq) 분석

 

🔍 Table S4 RNA-seq은 co-culture가 microglia 상태를 어떻게 바꾸는지 보여줌

🧪 그래서 뭘 했나?

이 논문에서는 iPSC 유래 인간 미세아교세포(iMG)에서 **CD68 기반 면역정제법(immunopurification)**을 이용해
20분 안에 phagosome만 골라내는 기술을 만들었다.
게다가 이건 사람 뇌조직에서도 쓸 수 있고, 분리된 phagosome은 단백질, 대사체 모두 분석 가능하다.

즉, “삼킨 걸 바로 까보는” 게 가능해진 셈.

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🔍 phagosome 안에서 뭐가 나왔냐면?

1. 시냅스 단백질 중 presynaptic 관련 단백질만 다수 발견
   → synapse pruning의 specificity 힌트
2. **Quinolinic acid (QA)**가 파고좀 안에 존재
   → microglia에서만 생성되는 NMDA agonist, neurotoxic
   → 하지만 여기선 NAD⁺ 생합성 전구체로 기능
3. QA는 QPRT 효소를 통해 **nicotinic acid → NAD⁺**로 전환
   → 파고좀이 단순 분해소기관이 아니라, 대사 활성 compartment라는 주장

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🧬 이게 왜 중요하지?

QA는 염증성 환경에서 과도하게 축적되면 신경독성을 유발한다.
그런데 이 논문은 QA가 phagosome 내부에서 대사되는 과정까지도 compartmentalized 되어 있다는 걸 보여줌.

→ 파고좀 안에서도 에너지 회복 경로(NAD⁺ 생합성)가 작동한다는 뜻
→ microglia가 debris 정리만 하는 게 아니라, 자체 에너지 조절도 한다는 거지

 

아래는 Figure 별로 설명함. 

✅ Figure 1: 파고좀만 쏙 뽑아내는 기술 개발!

🔍 왜 했나?
사람 미세아교세포에서 phagosome compartment만 분리하는 건 너무 어려웠음.
그래서 새로운 분리법이 필요했음.

🧪 뭘 했나?

• iPSC 유래 microglia(iMG) 만들고
• CD68을 타겟으로 면역정제(IP)
• 단백질과 효소 활성(N-acetyl-hexosaminidase) 분석
• Confocal 이미지로 phagosome 내부 입자 확인

🎯 무슨 의미?
→ 사람 iMG에서도 고순도 phagosome 분리 가능!
→ 기능도 살아있음! (즉, 대사 가능)

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✅ Figure 2: 파고좀 안에는 어떤 단백질들이 있을까?

🔍 왜 했나?
분리한 파고좀이 진짜 기능하는 compartment인지 단백질 구성을 확인해야 함

🧪 뭘 했나?

• LC-MS로 phagosome 단백질 전체 분석
• volcano plot + GO term 분석
• 막 단백질 vs 용해성 단백질 분리 (carbonate extraction)

🎯 무슨 의미?
→ phagosome은 lysosome-like 특성이 강함
→ 진짜로 대사 및 분해 중심 compartment임이 입증됨

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✅ Figure 3: 환경이 바뀌면 phagosome도 바뀐다!

🔍 왜 했나?
microglia의 **상태(co-culture, LPS 자극 등)**에 따라
phagosome 단백질이 달라질까?

🧪 뭘 했나?

• 조건: monoculture / co-culture / +LPS-IFNγ
• LC-MS로 phagosome 단백질 분석 (UpSet, volcano, heatmap)
• RNA-seq도 병행 (Table S4와 연결)

🎯 무슨 의미?
→ 염증 자극 or neuron과의 상호작용에 따라
phagosome 단백질이 유연하게 바뀜
→ 단백질 변화 ≠ 유전자 변화 → post-transcriptional 조절도 있음!

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✅ Figure 4: 파고좀 안에 대사체도 들어있다고?

🔍 왜 했나?
단백질만 있는 게 아니라 대사체도 담겨 있을까?

🧪 뭘 했나?

• phagosome에서 대사체 분석 (LC-MS)
• QA, NA 등 Kynurenine pathway 관련 대사체 검출

🎯 무슨 의미?
→ phagosome은 단백질 분해소일 뿐 아니라
대사 활성 compartment일 수도 있다!

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✅ Figure 5: QA → NAD⁺ 대사가 진짜 phagosome 안에서 일어남!

🔍 왜 했나?
QA가 정말 NAD⁺ 생합성으로 이어지는가?
그게 phagosome 내부에서 가능한가?

🧪 뭘 했나?

• 13C-labeled tryptophan 처리 후 대사 추적
• phagosome 분획에서 13C-QA, 13C-NA 검출
• 37℃ 처리 시 QA 감소, NA 증가 → QPRT 작용 입증

🎯 무슨 의미?
→ phagosome 안에서 QA → NAD⁺ 생합성 경로 작동
→ compartmentalized metabolism 개념 정립!

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✅ Figure 6: 이 기술은 실제 사람 뇌조직에서도 된다!

🔍 왜 했나?
iMG 말고 진짜 사람 뇌조직에서도 phagosome 분석이 가능할까?

🧪 뭘 했나?

• 수술로 얻은 신선한 사람 뇌조직으로부터 CD68+ phagosome 분리
• EM 이미지에서 gold-labeled LAMP1 확인
• LC-MS 단백질 분석 → iMG와 비교

🎯 무슨 의미?
→ 진짜 환자 조직에서도 사용 가능한 기술!
→ translational 가능성 있음

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✅ Figure 7: 종양환경(TAM)에서도 phagosome 대사체 변화가 일어난다!

🔍 왜 했나?
염증성 환경에서는 phagosome 대사가 어떻게 바뀔까?

🧪 뭘 했나?

• glioblastoma 조직에서 CD68+ TAM phagosome 분리
• 대사체 분석 → QA 증가 확인
• Kynurenine pathway 관련 효소 발현도 변화

🎯 무슨 의미?
→ 질병 환경에서도 phagosome은 독특한 대사 활동을 함
→ QA 축적이 병리적 역할 할 가능성 있음

 

🧠  Discussion 

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✅ 1. 기존 한계: 인간 microglial phagosome 연구는 너무 어려웠다

• 지금까지 **microglia의 식작용(phagocytosis)**은 단순 세포배양(monoculture) 또는 동물 모델에서만 주로 연구됨
• 하지만 이런 방식은:
  • 실제 사람 뇌와 너무 다름
  • phagosome만을 분리해서 대사까지 분석하기엔 속도와 순도, 해상도 모두 부족
  • 특히 기존 방식(sucrose gradient 등)은 대사체 분석에 부적합

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✅ 2. 새로운 방법: 빠르고 순도 높은 phagosome 분리 → 다중 오믹스 분석 가능!

• CD68 기반 면역정제 방식을 통해
  • iPSC 유래 microglia (iMG)
  • neural co-culture system
  • 실제 사람 뇌조직 모두에서 intact한 phagosome을 분리해냄
• 이 방법은:
  • 단백질 (proteome)
  • 대사체 (metabolome)
  • RNA 발현 (bulk RNA-seq) 모두 고해상도로 compartment별 분석 가능하게 함

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✅ 3. 새로운 발견: phagosome은 대사 중심소기관이다 (특히 QA → NAD⁺ 경로)

• microglia는 뇌에서 유일하게 **kynurenine pathway를 통해 QA → NAD⁺**를 생성하는 세포
• 이 논문은 처음으로:
  • QA가 세포 내에서 만들어져서 phagosome 안에 저장되고
  • QPRT에 의해 NAD⁺ 생합성 경로로 대사됨을 입증
• 이 현상은:
  • **염증 상황 (ex. glioblastoma)**에서 QPRT 발현이 낮을 경우 QA 축적 → 신경독성 증가
  • 반대로 QPRT가 높으면 QA를 면역조절물질 (NA)로 전환, NAD⁺ 생성까지 이어짐

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💡 결론: phagosome은 단순한 "청소기"가 아니라 microglia의 대사 조절 허브(hub)

• 이 compartment는:
  • 시냅스 성분 (특히 presynapse) 선별적 제거
  • QA 대사 및 NAD⁺ 생성
  • 대사적 상태에 따라 microglia의 phenotype까지 조절

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⚠️ 한계점도 언급함

한계설명

CD68+ organelle은 꼭 phagosome만은 아님	late endosome, lysosome도 포함 가능
compartment별 구분은 추가 방법 필요	ex. 면역형광공초점, 단일소기관 proteomics 등
glioblastoma 분석은 환자 1명 샘플에 한정	향후 환자 수 확장 필요

 

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